Химическая модификация поверхности клеток человека для получения биогибридов

Аннотация
Инновационные химические и биологические технологии получения биогибридных структур медицинского назначения разрабатываются на основе клеток человека. Для этой цели живые клетки гибридизуются с биологически активными молекулами. В данном исследовании были решены следующие задачи: разработаны оптимальные условия получения биогибридов с помощью реакции азид-алкинового циклоприсоединения, промотируемого напряжением (SPAAC), между N-азидоацетилманнозамином, введенного в состав поверхностного пептидогликана клеток, и дибензоциклооктиновым производным флуоресцентного красителя Cy5; синтезирован конъюгат анти-VEGF пептида c дибензоциклооктином для последующего получения биогибридов, способных селективно связывать белок VEGF; синтезирован конъюгат фолиевой кислоты с дибензоциклооктином для последующего получения биогибридов, способных селективно распознавать опухолевые клетки, проявляющие повышенную экспрессию рецепторов к фолиевой кислоте (FOLR1).
В результате исследования были найдены оптимальные условия реакции хемоселективного лигирования поверхности живых клеток человека (суспензия Т-лимфоцитов Jurkat и адгезионные клетки карциномы предстательной железы PC3) для создания биогибридов. Был получен биогибрид, состоящий из клеток T-лимфоцитов Jurkat, лигированных анти-VEGF пептидом, селективно связывающим фактор роста эндотелия VEGF. Полученные биогибриды обладают биологической активностью, которая проявлялась в частичном подавлении пролиферации пигментных эпителиальных клеток сетчатки глаза человека (ARPE-19). Также был получен биогибрид, состоящий из клеток T-лимфоцитов Jurkat, лигированных с фолиевой кислотой. Биологическая активность полученного биогибрида нуждаются в дальнейших исследованиях. Разработанные химические и биологические технологии для создания биогибридных платформ могут стать основой новых подходов персонализированной терапии широкого спектра заболеваний.

Abbreviations —————————————————————————————————— 6
Chapter 1. Introduction —————————————————————————————-9
1.1 The Reactions of Bioconjugation——————————————————————- 10
1.1.1 Chemoselective Ligation: Bioorthogonal Reagents —————————————- 10
1.1.2 Bioorthogonal chemistry ———————————————————————– 12
1.1.2.1 The Staudinger Ligation —————————————————————— 14
1.1.3 Click chemistry Reactions ——————————————————————— 16
1.1.3.1 Cu-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC)——————————- 18
1.1.3.2 Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) ————————— 20
1.1.4 Application of Bioorthogonal Chemistry for Glycan Bioconjugations—————— 20
1.1.5 Applications of Click Chemistry for Drug Delivery in the Diagnosis and Treatment of
Diseases.—————————————————————————————————– 25
1.2 Vascular Endothelial Growth Factor ————————————————————— 28
1.2.1 VEGFA and VEGF receptors—————————————————————— 29
1.2.2 VEGF Isoforms ———————————————————————————- 29
1.2.3 Regulation of VEGFA gene expression—————————————————— 31
1.2.4 VEGF Signaling Pathway ———————————————————————- 32
1.2.5 Inhibition of VEGF family signaling ——————————————————— 35
1.2.5.1 Antibodies to VEGF———————————————————————– 36
1.2.5.2 Tyrosine Kinase Inhibitors ————————————————————— 38
1.3 Folic Acid ———————————————————————————————- 40
1.3.1 Role of FR expression in personalized cancer therapy ———————————— 44
1.3.2 FR-targeted therapeutics in personalized cancer therapy ———————————- 47
1.3.2.1 FR-targeted mAbs ————————————————————————- 48
1.3.2.2 Folate cytotoxic drug conjugates ——————————————————– 49
4
Chapter 2. Materials and Methods————————————————————————- 50
2.1 Materials ———————————————————————————————– 50
2.2 Methods ———————————————————————————————— 51
2.2.1 Metabolic labeling and chemoselective ligation of living cells————————— 51
2.2.2 MTT-cell Viability Assay ———————————————————————- 53
2.2.3 Synthesis of anti-VEGF and Dibenzocyclooctyne conjugate —————————– 55
2.2.4 Synthesis of Ethylenediamine Folic Acid and Dibenzocyclooctyne conjugate ——– 55
2.2.4.1 N-BOC ethylenediamine—————————————————————— 59
2.2.4.2 N‐BOC ethylenediamine‐folate———————————————————- 60
2.2.4.3 Ethylenediamine‐folate ——————————————————————- 61
2.2.4.4 DBCO‐Ethylenediamine‐folate ———————————————————- 61
Chapter 3. Results and discussion ————————————————————————- 62
3.1 Development of optimal conditions for creation of biohybrids in SPAAC reaction. ——- 62
3.2 Creation of biohybrids capable of selectively binding a VEGF protein ———————- 67
3.3 Creation of biohybrids capable of selectively recognizing tumor cells overexpressing folate
receptor ——————————————————————————————————— 71
Conclusion——————————————————————————————————– 77 References ——————————————————————————————————– 78